高鐵螯合物還原酶（FCR）活性檢測試劑盒說明書

微量法

貨號：BC5915

規格：100T/96S

產品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致，有疑問請及時聯系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1、 顯色液：臨用前根據樣本數量按照試劑一：試劑二：試劑三=50μL：50μL：50μL（150μL，1T）的比例配制顯色液，充分混勻，現配現用。

2、 標準品：臨用前加入0.71mL蒸餾水和10μL濃硫酸，配制成50μmol/mL Fe²⁺標準液。溶解好的標準品2-8℃可以保存2周。

3、 62.5nmol/mL標準溶液的配制：臨用前取50μL 50μmol/mL Fe²⁺標準液和950μL蒸餾水混合配制成2.5μmol/mL 標準溶液；再吸取25μL 2.5μmol/mL（2500nmol/mL）和975μL蒸餾水混合配制成62.5nmol/mL標準溶液備用。

產品說明：

雙子葉植物和非禾本科單子葉植物采用鐵螯合還原反應的高效活化和吸收機制從土壤中獲取鐵。三價鐵還原為二價鐵后才能被植物吸收利用。在鐵充足時，植物根部的三價鐵氧化還原酶將Fe(III)-螯合物中的鐵還原并將還原所得Fe²⁺轉運通過細胞質膜進入根細胞內。高鐵螯合物還原酶（Ferric chelate reductase，FCR，EC1.16.1.7）催化Fe³⁺還原為Fe²⁺，Fe²⁺和菲洛嗪形成紫色絡合物，在562nm下有特征吸收峰。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計/酶標儀、低溫離心機、分析天平、可調式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、研缽/勻漿器、濃硫酸（95%-99% AR）、冰和蒸餾水。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當調整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）

1. 組織樣本：按質量（g）: 提取液體積（mL）1 : 5~10比例加入提取液（建議稱取0.1g樣本，加入1.0mL提取液），冰浴勻漿后，于4℃，8000g，離心10min，棄沉淀，取上清液置于冰上待測。

2. 液體樣本：直接測定。若液體有渾濁則離心取上清測定。

二、測定步驟

1．可見分光光度計/酶標儀預熱30min以上，調節波長至562nm，可見分光光度計用蒸餾水調零。

2．顯色液臨用前平衡至常溫。

3．標準管測定

吸取50μL 62.5nmol/mL Fe²⁺標準液，加入150μL顯色劑，充分混勻，測定562nm下的吸光度，記為A標準，此時Fe²⁺終濃度為15.625nmol/mL，標準管只需做1-2次。

4．空白管測定

吸取50μL蒸餾水，加入150μL顯色劑，充分混勻，測定562nm下的吸光度，記為A空白，計算ΔA標準=A標準-A空白，空白管只需做1-2次。

5．操作表：（在微量玻璃比色皿或96孔板中以下試劑）

三、高鐵螯合物還原酶（FCR）活性計算

（1）按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg組織蛋白在每mL體系中每分鐘生成1nmol Fe²⁺定義為一個酶活力單位。

FCR活性(U/mg prot)= ΔA×C標÷ΔA標準×V總÷(Cpr×V樣) ÷T=2.083×ΔA÷ΔA標準÷Cpr

（2）按樣本質量計算：

單位的定義：每g組織在每mL體系中每分鐘生成1nmol Fe²⁺定義為一個酶活力單位。

FCR活性(U/g 質量) =ΔA×C標÷ΔA標準×V反總÷(W÷V提取×V樣) ÷T =2.083×ΔA÷ΔA標準÷W

C標：Fe²⁺標準液最終濃度，15.625nmol/mL；V反總：反應體系總體積，0.2mL；Cpr：上清液蛋白濃度，mg/mL；V 樣：加入反應體系中上清液體積，50μL=0.05mL；V提取：加入提取液體積，1mL； T：反應時間，30min；W：樣本質量，g。

注意事項：

1、 如果?A小于0.010或測定管吸光值接近空白管，可以增加樣本量或者延長反應時間后再進行測定；如果?A大于1或者A1大于1，建議將樣本上清用提取液適當稀釋后再進行測定。注意同步修改計算公式。

實驗實例：

1、 稱取0.1214g櫻桃番茄，加入提取液進行冰浴勻漿，按照測定步驟操作，用96孔板測得計算ΔA= A2-A1=0.665-0.127=0.538，ΔA標準=A標準-A空白=0.525-0.083=0.442，帶入公式計算：

FCR活性(U/g 質量) =2.083×ΔA÷ΔA標準÷W=20.885 U/g 質量

2、 稱取0.1002g閩南葉片，加入提取液進行冰浴勻漿，按照測定步驟操作，用96孔板測得計算ΔA= A2-A1=0.188-0.104=0.084，ΔA標準=A標準-A空白=0.525-0.083=0.442，帶入公式計算：

FCR活性(U/g 質量) =2.083×ΔA÷ΔA標準÷W=3.951U/g 質量

參考文獻：

[1] Shabnam N , Kim M , Kim H .Iron (Ⅲ) oxide nanoparticles alleviate arsenic induced stunting in Vigna radiata[J].Ecotoxicology and Environmental Safety, 2019, 183(Nov.).

[2 Kabir A H , Akther M S , Skalicky M ,et al.Downregulation of Zn-transporters along with Fe and redox imbalance causes growth and photosynthetic disturbance in Zn-deficient tomato[J].Scientific Reports, 2021, 11(1).

[3] Ojeda M , Schaffer B , Davies F S .Root and Leaf Ferric Chelate Reductase Activity in Pond Apple and

Soursop[J].Journal of Plant Nutrition, 2005, 27(8):1381-1393.

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